肌成纖維細(xì)胞中ASPP1的缺失通過(guò)減少p53的降解來(lái)減輕心肌纖維化

心臟纖維化是多種慢性和急性心血管疾病的典型病理特征。心臟纖維化的特征是心臟中膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的過(guò)度產(chǎn)生和沉積。這種病理重構(gòu)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞和心肌功能障礙，最終損害心臟的機(jī)械、電和血管舒張功能。因此，闡明控制心臟纖維化的分子機(jī)制對(duì)于建立有效的治療策略至關(guān)重要。

p53蛋白（ASPP）家族的凋亡刺激蛋白是一組參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的蛋白。其中，ASPP1和ASPP2通過(guò)增強(qiáng)p53的促凋亡功能激活p53介導(dǎo)的促凋亡基因轉(zhuǎn)錄，而iASPP的作用則相反。在之前的工作中，作者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)ASPP1通過(guò)與p53結(jié)合，促進(jìn)心肌凋亡，加重了缺血再灌注損傷后的心肌功能障礙。然而，ASPP1缺失可改善心功能，梗死面積減少，心肌細(xì)胞凋亡減少。在機(jī)制上，ASPP1促進(jìn)了p53的核易位，并增強(qiáng)了促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。p53是抑制癌細(xì)胞增殖的典型腫瘤抑制因子。異常的成纖維細(xì)胞激活在生物學(xué)上類似于致癌性惡性腫瘤中不受限制的細(xì)胞增殖。腫瘤抑制因子p53也參與了肺和心臟纖維化的發(fā)展。有趣的是，初步發(fā)現(xiàn)，與ASPP1對(duì)心肌細(xì)胞p53活性的促進(jìn)作用相比，它降低了心肌成纖維細(xì)胞中p53水平，增加了成纖維細(xì)胞增殖和膠原的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究ASPP1在梗死后心臟纖維化中的作用和分子機(jī)制。

去泛素化是一個(gè)可逆的泛素化過(guò)程，在調(diào)節(jié)蛋白定位和底物蛋白降解中起著至關(guān)重要的作用。該過(guò)程從修飾的底物中消除泛素分子。越來(lái)越多的證據(jù)表明，去泛素酶Otubain 1（OTUB1）調(diào)節(jié)許多與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲性和耐藥性。已有報(bào)道指出，OTUB1可以去除p53中的泛素或多聚泛素，并增加p53的穩(wěn)定性。

在本研究中，證實(shí)了ASPP1通過(guò)與OTUB1結(jié)合，增強(qiáng)p53的泛素化和降解，從而作為心肌纖維化的正調(diào)控因子。在肌成纖維細(xì)胞中抑制ASPP1可顯著減輕心肌纖維化。本文研究表明，靶向ASPP1在治療心臟纖維化中具有相當(dāng)大的潛力。

ASPP1在心臟纖維化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)

為了研究ASPP1在心臟纖維化中的潛在作用，首先檢測(cè)了其在慢性（4周）心肌梗死模型和TGF- β1處理的原代小鼠心臟成纖維細(xì)胞（PMCFs）中的表達(dá)變化。心肌梗死后4周，小鼠心臟梗死區(qū)ASPP1的mRNA和蛋白水平均升高。ASPP1在心肌梗死4周期間呈動(dòng)態(tài)增加（圖1a，b）。同樣，在用TGF-β1處理的PMCFs中，觀察到ASPP1表達(dá)上調(diào)（圖1c，d）。

整體ASPP1缺失可減輕心肌梗死后的心肌纖維化

   在之前的研究中，使用CRISPR/Cas9策略生成了ASPP1常規(guī)敲除（KO）小鼠（C57BL/6背景）（7-8周齡，22-25 g）。ASPP1-KO小鼠出生后生長(zhǎng)正常。采用ASPP1-KO小鼠，探討ASPP1在心肌梗死后心肌纖維化中的功能作用（圖2a）。心臟超聲心動(dòng)圖的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和時(shí)間安排如圖2b所示。western blot檢測(cè)證實(shí)ASPP1的KO成功（圖2c）。

心肌梗死4周后，WT小鼠的死亡率為49%，而ASPP1-KO小鼠的死亡率降低至16%（圖2d）。超聲心動(dòng)圖檢查顯示，WT和ASPP1-KO小鼠在基線時(shí)的收縮功能無(wú)差異。在心肌梗死后2周和4周，ASPP1的缺失顯著改善了心功能，這表明左心室射血分?jǐn)?shù)（EF%）和縮短分?jǐn)?shù)（FS%）增加（圖2e）。ASPP1缺失降低了心肌梗死后4周的心臟重量與體重（HW/ BW）和梗死面積的比值（圖2f，g）。值得注意的是，ASPP1 KO降低了ECM蛋白Col1、Col3和Fn1以及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和Postn的表達(dá)（圖2h，i）。這些數(shù)據(jù)表明，ASPP1缺失可以防止心肌梗死后的左心室不良重構(gòu)。

肌成纖維細(xì)胞ASPP1的缺失限制了纖維化重構(gòu)，并保留了損傷心臟的功能

由于ASPP1缺失對(duì)缺血損傷時(shí)的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，上述ASPP1缺失對(duì)慢性心肌梗死的有益作用可能是由于心肌細(xì)胞中ASPP1缺失引起的。然后，使用他莫昔芬誘導(dǎo)的Postn啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的MerCreMer轉(zhuǎn)基因（Postn^MCM）技術(shù)在肌纖維母細(xì)胞中生成條件性ASPP1缺失，以探索ASPP1對(duì)梗死后心臟重構(gòu)的貢獻(xiàn)。將Postn^MCM小鼠與ASPP1^fl/fl小鼠雜交，獲得ASPP1^fl/fl Postn^MCM小鼠（圖3a）。心肌梗死術(shù)后給予他莫昔芬（TAM）ASPP1^fl/flPostn^MCM或ASPP1^+/+ Postn^MCM小鼠5天，誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞（ASPP1）中ASPP1缺失，并進(jìn)一步檢查（圖3b）。

在ASPP1-CKO小鼠中，ASPP1蛋白水平顯著下調(diào)（圖3c）。心肌梗死后4周，ASPP1-CKO小鼠的存活率明顯高于ASPP1^+/+Postn^MCM小鼠。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了肌成纖維細(xì)胞中ASPP1的缺失可改善心肌功能，并防止心肌梗死后發(fā)生不良的心臟重構(gòu)。

ASPP1在體外促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的活化和膠原蛋白的產(chǎn)生

為了評(píng)估ASPP1在體外成纖維細(xì)胞增殖、分化和ECM產(chǎn)生中的作用，通過(guò)轉(zhuǎn)染了ASPP1 siRNA到培養(yǎng)的pmcf中敲除其表達(dá)（圖4a）。ASPP1的沉默降低了TGF-β1處理的pmcf中的Col1和Fn1的mRNA和蛋白水平（圖4b-d）。EdU染色顯示，在TGF-β1處理的pmcf中，ASPP1沉默明顯抑制細(xì)胞增殖（圖4e）。然后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞周期階段的DNA含量，以評(píng)估PMCFsf的增殖狀態(tài)。ASPP1敲低導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，在TGF-β1處理的PMCFs中，S期細(xì)胞從29.07%減少到15.83%。S1a)。免疫熒光染色顯示，在TGF-β1處理后的PMCFs中，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著減少（圖4f）。

然后，在培養(yǎng)的PMCFs中過(guò)表達(dá)ASPP1（圖4g）。與預(yù)期的一樣，過(guò)表達(dá)ASPP1增加了Col1和Fn1的mRNA和蛋白水平（圖4h-j）。過(guò)表達(dá)ASPP1促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，更多的EdU陽(yáng)性細(xì)胞證明了這一點(diǎn)。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，ASPP1過(guò)表達(dá)組有29.6%的細(xì)胞處于S期，對(duì)照組有19.6%的細(xì)胞處于S期。(圖4k和S1b)。此外，與對(duì)照組相比，ASPP1過(guò)表達(dá)組的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞率顯著升高（圖4l）。

ASPP1在心臟成纖維細(xì)胞中調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路

由于p53在成纖維細(xì)胞激活和心臟纖維化中至關(guān)重要，作者推測(cè)ASPP1可能通過(guò)影響p53來(lái)調(diào)節(jié)心臟纖維化。心肌梗死后4周，ASPP1的整體和肌成纖維細(xì)胞條件性KO均顯著恢復(fù)了梗死區(qū)p53蛋白水平（圖5a）。ASPP1的下調(diào)顯著上調(diào)了TGF-β1處理的PMCFs中的p53水平，而過(guò)表達(dá)ASPP1顯著抑制了PMCFs中p53的表達(dá)（圖5b）。然而，p53在ASPP1上調(diào)和下調(diào)作用中的mRNA水平?jīng)]有明顯影響（圖5c），在ASPP1整體KO小鼠和肌成纖維細(xì)胞KO小鼠中沒有差異(圖。S2a, b)。此外，心肌梗死小鼠ASPP1或ASPP1沉默的肌成纖維細(xì)胞KO顯著促進(jìn)有絲分裂細(xì)胞周期蛋白Ccna2、Ccnb1、Ccne1和Cdk1的表達(dá)，并抑制Cdk1抑制劑Cdkn1a的表達(dá)(圖。5d和S2c，d)。當(dāng)ASPP1過(guò)表達(dá)時(shí)，可以觀察到相反的作用（圖5e）。值得注意的是，除了參與細(xì)胞周期的p53外，ASPP1的干擾對(duì)其他經(jīng)典靶基因沒有顯著影響(圖。S2e, f)。免疫熒光研究顯示，在TGF-β1處理的PMCFs中，下調(diào)ASPP1導(dǎo)致p53的上調(diào)和核積累（圖5f），而過(guò)表達(dá)ASPP1顯著降低了p53的總水平和核水平（圖5g）。此外，還進(jìn)一步研究了ASPP1在纖維化中的生物學(xué)功能是否依賴于p53。發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1處理的PMCFs中，下調(diào)p53顯著抑制了抑制ASPP1對(duì)Col1和Fn1表達(dá)的抑制作用（圖5h）。抑制p53可通過(guò)敲除ASPP1進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖，恢復(fù)細(xì)胞增殖和有絲分裂細(xì)胞周期蛋白基因的表達(dá)(圖。S3c, d.此外，p53的過(guò)表達(dá)消除了ASPP1對(duì)PMCFs中Col1和Fn1表達(dá)的促進(jìn)作用（圖5i）。此外，p53的過(guò)表達(dá)降低了成纖維細(xì)胞的增殖率，并改變了ASPP1誘導(dǎo)的細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。(圖S3e, f)。p53的敲除和過(guò)表達(dá)效率如圖S1a, b所示。

接下來(lái)，研究了ASPP1對(duì)p53蛋白穩(wěn)定性的影響機(jī)制。使用環(huán)己酰亞胺檢測(cè)了p53的半衰期。抑制ASPP1延長(zhǎng)了p53的半衰期，過(guò)表達(dá)ASPP1縮短了p53的半衰期 (圖S4a, b)。用蛋白酶體抑制劑MG132處理PMCFs可抑制ASPP1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的p53下調(diào)（圖6a），表明ASPP1可能通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控p53的降解。然后，對(duì)TGF-β1處理過(guò)的PMCFs進(jìn)行了共免疫沉淀（co-IP）和質(zhì)譜（MS）分析，以篩選與ASPP1結(jié)合并具有調(diào)節(jié)p53泛素化和降解潛力的蛋白（圖6b）。共鑒定出2526個(gè)蛋白。KEGG分析顯示，許多蛋白質(zhì)參與了蛋白質(zhì)的折疊和降解，其中包括去泛素化酶OTUB1，據(jù)報(bào)道它可以調(diào)節(jié)p53的降解19。隨后，驗(yàn)證了ASPP1抗體在TGF-β1處理的TGF中沉淀了OTUB1，反之亦然（圖6c）。OTUB1基因的沉默抑制了ASPP1基因下調(diào)導(dǎo)致的p53基因的上調(diào)（圖6d）。OTUB1的敲除效率如圖所示。S5a.此外，過(guò)表達(dá)OTUB1完全恢復(fù)了ASPP1處理后的PMCFs中p53的表達(dá)（圖6e）。OTUB1的過(guò)表達(dá)效率如圖S5b所示。這些數(shù)據(jù)表明，OTUB1介導(dǎo)了ASPP1對(duì)p53蛋白水平的調(diào)控。

討論

ASPP1通過(guò)促進(jìn)BAX表達(dá)，抑制Bcl2表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)速率。在心臟缺血-再灌注損傷中，ASPP1促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重?fù)p害心功能。與ASPP1在癌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的促凋亡作用不同，在本研究中發(fā)現(xiàn)了ASPP1促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)心肌纖維化發(fā)展的有趣能力。ASPP1通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核激活p53或p53家族成員，選擇性發(fā)揮促凋亡作用，增強(qiáng)p53下游22的促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中，發(fā)現(xiàn)ASPP1負(fù)調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞中p53蛋白水平。

值得注意的是，p53在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在心肌纖維化過(guò)程中，它通過(guò)其細(xì)胞周期阻滯功能來(lái)抑制成纖維細(xì)胞的增殖，從而抑制心肌纖維化的進(jìn)展。p53抑制細(xì)胞周期在G1/G0期和阻止其進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。發(fā)現(xiàn)ASPP1促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖和纖維化，這可以通過(guò)其對(duì)心臟成纖維細(xì)胞中p53的負(fù)調(diào)控來(lái)解釋。p53主要作為細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)直接調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其影響。在缺血-再灌注損傷中，p53通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2和Puma積累并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。另一方面，PAI-1通過(guò)提高p53的表達(dá)，進(jìn)而激活p53-p21-rb細(xì)胞周期抑制通路，從而誘導(dǎo)纖維化肺疾病中的肺泡2型細(xì)胞衰老。ASPP1通過(guò)調(diào)節(jié)p53來(lái)控制細(xì)胞功能。當(dāng)RAS被激活時(shí)，ASPP1積累并驅(qū)動(dòng)p53和p53家族成員到細(xì)胞核，增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄和凋亡功能。在心臟缺血/再灌注（I/R）損傷中，ASPP1和p53的相互作用導(dǎo)致它們通過(guò)輸入蛋白-β1同時(shí)易位到細(xì)胞核中，最終促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在心臟成纖維細(xì)胞中，ASPP1可以抑制p53并增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的增殖。ASPP1的缺失促進(jìn)了p53的核定位，而p53核定位的積累顯著抑制了纖維化的進(jìn)展。由于ASPP1對(duì)p53表達(dá)的相反調(diào)控，可以觀察到ASPP1在不同細(xì)胞類型中的相反的生物學(xué)效應(yīng)。例如，ASPP1增加心肌細(xì)胞p53水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

已經(jīng)證明，相同的分子或途徑可能在不同的細(xì)胞或組織類型中發(fā)揮不同的或相反的生物學(xué)功能。據(jù)報(bào)道，泛素特異性肽酶7（USP7）通過(guò)在細(xì)胞過(guò)程中與p53相互作用而產(chǎn)生多種功能。USP7通過(guò)直接穩(wěn)定p53來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。然而，USP7通過(guò)與小鼠結(jié)合并穩(wěn)定MDM2，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活和心肌纖維化，從而導(dǎo)致p53降解。之前曾報(bào)道過(guò)，p53通過(guò)上調(diào)Puma、Bax和Noxa來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，從而加重了缺血-再灌注損傷。有趣的是，在本研究中，p53主要上調(diào)Cdkn1a，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯而不是凋亡，從而防止心臟成纖維細(xì)胞的異常增殖，減輕心臟的負(fù)擔(dān)。發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)新的見解，ASPP1是心臟纖維化的新監(jiān)管機(jī)構(gòu)，而且，更重要的是，同樣的基因操作策略沉默ASPP1，抑制心肌細(xì)胞而促進(jìn)成纖維細(xì)胞，可以產(chǎn)生心臟保護(hù)作用反映在減少心肌纖維化和通過(guò)p53表達(dá)的差異調(diào)節(jié)機(jī)制增加心肌細(xì)胞的生存。不同的細(xì)胞或組織表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能和對(duì)刺激/應(yīng)激的反應(yīng)，這主要依賴于不同的細(xì)胞特異性成分和信號(hào)通路。細(xì)胞/組織對(duì)一種刺激的不同反應(yīng)在臨床研究和治療中具有重要的潛力和意義。

p53的泛素化修飾是改變其蛋白水平的一個(gè)關(guān)鍵的翻譯后修飾。去泛素化修飾是一種泛素化的可逆機(jī)制，它持續(xù)控制蛋白質(zhì)水平，維持體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。先前的研究表明，去泛素化蛋白酶USP9X參與了與MDM2的相互作用，MDM2是p53中經(jīng)典的E3泛素連接酶，可誘導(dǎo)MDM2的積累，從而導(dǎo)致p53的泛素化和降解。OTUB1通過(guò)與p53的相互作用作為一種去泛素化酶。OTUB1直接抑制細(xì)胞質(zhì)中p53的泛素化，穩(wěn)定和激活p53，誘導(dǎo)p53依賴的凋亡和劇烈的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。在本研究中，發(fā)現(xiàn)大量的ASPP1限制了p53與OTUB1之間的相互作用，最終導(dǎo)致p53的泛素化和降解。

心肌梗死后，心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)歷表型從靜止?fàn)顟B(tài)的表型轉(zhuǎn)換。這些活化的CFs或肌成纖維細(xì)胞在愈合階段和膠原沉積中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致。肌成纖維細(xì)胞的豐富存在導(dǎo)致ECM積累導(dǎo)致纖維化，這大大增加了發(fā)病率和死亡率。在這里，發(fā)現(xiàn)心肌梗死發(fā)病后ASPP1的肌成纖維細(xì)胞KO對(duì)小鼠心肌纖維化的進(jìn)展有很強(qiáng)的抑制作用。抑制肌成纖維細(xì)胞中ASPP1的表達(dá)可顯著改善心肌梗死后的心肌功能和減少梗死面積。本研究采用PostnMCM策略刪除ASPP1，從而顯著減輕心肌纖維化。然而，Postn也在其他類型的細(xì)胞中表達(dá)，如血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。因此，不能排除這些細(xì)胞對(duì)ASPP1缺失反應(yīng)的心臟保護(hù)的潛在貢獻(xiàn)。因此，ASPP1是心肌梗死后心肌纖維化在臨床實(shí)施中的潛在治療靶點(diǎn)。

研究結(jié)果顯示，在心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞中抑制ASPP1對(duì)小鼠的心功能都產(chǎn)生了有益的影響。因此，抑制ASPP1可能是預(yù)防心肌梗死或減少缺血-再灌注損傷的良好策略。目前，除了siRNA或shRNA外，目前還沒有針對(duì)ASPP1的小分子抑制劑。抑制ASPP1可以通過(guò)利用蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)來(lái)特異性地降低成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞中ASPP1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

p53穩(wěn)定劑的應(yīng)用，如nutlin MDM2抑制劑，可以阻止p53的降解，并導(dǎo)致心肌細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中p53蛋白的增加?？梢酝茰y(cè)，p53抑制成纖維細(xì)胞活性可以抑制心肌纖維化，而p53的促凋亡功能可能通過(guò)p53促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。然而，抑制ASPP1可能通過(guò)增加肌成纖維細(xì)胞中的p53來(lái)抑制纖維化，并通過(guò)減少p53和心肌細(xì)胞凋亡來(lái)減輕心臟損傷。因此，抑制ASPP1對(duì)成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞都產(chǎn)生有益的作用，這可能是比僅抑制MDM2抑制劑nutlin抑制p53降解更好的策略。然而，這還需要用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證明。

盡管有這些有趣的發(fā)現(xiàn)，但這項(xiàng)研究仍有一些局限性。首先，證實(shí)了ASPP1通過(guò)與OTUB1的相互作用負(fù)調(diào)控p53的穩(wěn)定性，而不能排除其他蛋白參與了這一過(guò)程。其次，證實(shí)了抑制ASPP1具有抗纖維化作用。然而，并沒有發(fā)現(xiàn)一種能抑制心臟纖維化的ASPP1特異性抑制劑。最后，ASPP1在心臟纖維化中如何升高的具體機(jī)制以及它如何促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。綜上所述，研究表明，ASPP1在病理性心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。抑制ASPP1可減輕心肌梗死患者的心功能障礙，預(yù)防心臟纖維化。ASPP1和OTUB1之間的相互作用促進(jìn)了p53的泛素化和隨后的降解，從而促進(jìn)了心臟成纖維細(xì)胞的激活和心肌纖維化的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)為病理性心肌纖維化的分子機(jī)制提供了獨(dú)特的見解，并為心肌纖維化提供了新的治療策略。

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