細胞活力檢測(MTT法)

細胞活力檢測(MTT法)

原理

噻唑蘭，簡稱MTT，可透過細胞膜進入細胞內，活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍紫色的Formazan結晶并沉積在細胞中，結晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細胞數量。

普通MTT法實驗步驟

1、細胞接種：將細胞懸液以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200μl；

2、 細胞培養：將96孔板放入37℃，5%CO₂培養箱培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）；

3、呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4) 10μl，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液（對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液），每孔加100μl DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。

4、比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

藥物MTT法實驗步驟（貼壁細胞）
1、收集對數期細胞，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積100μl；

2、將96孔板放入37℃，5%CO₂培養箱培養至細胞單層鋪滿96孔板底部，加入濃度梯度的藥物（原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但通常在前一天下午鋪板，次日上午加藥），一般5-7個梯度，每孔100μl，設3-5個復孔；

3、在37℃，5%CO₂培養箱中孵育16-48小時，在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態；

4、每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h；

5、終止培養，小心吸去孔內培養液；

6、每孔加入100μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解；

7、在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值， 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。