靶向維生素B3代謝重編程作為化療耐藥癌癥的納米治療策略

癌癥相關成纖維細胞(CAFs)促進癌癥干細胞(CSC)介導的化療耐藥和免疫抑制腫瘤微環境。然而，直接消耗CAFs可能會增加癌癥的侵襲性和轉移。作為一種針對化療耐藥癌癥的通用策略，Gemini -樣同型靶向納米顆粒(NPs)被設計用于雙管齊下的CAFS轉化和癌細胞消除。在對各自的一線化療藥物耐藥的乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結直腸癌小鼠模型中，單劑量水凝膠共同遞送Gemini-like NPs可以恢復化療敏感性，誘導免疫激活，并實現腫瘤消退。此外，它還能刺激強健的T細胞記憶，長期具有抗腫瘤效果。因此，這項研究代表了一種具有廣泛適用性的創新方法來克服癌癥化療耐藥性。

首先，癌癥相關成纖維細胞(CAFs)是腫瘤微環境(TME)中活化的基質細胞，在癌癥進展中具有關鍵功能。它們產生纖維化的細胞外成分，形成物理屏障，損害藥物外顯性，限制免疫細胞浸潤。近年來的研究表明，CAFs在癌癥治療中有更多的不良反應。例如，CAFs構成癌癥干細胞(CSC)生態位的核心成分，分泌白細胞介素6 (il - 6)和il - 8來維持和富集CSC，并隨后誘導化療耐藥。此外，腫瘤基質中的CAFs通過產生多種趨化因子，包括用于趨化吸引髓源性抑制細胞(MDSCs)的C-X-C基序趨化因子配體1 (CXCL1)和C-C基序趨化因子配體2 (CCL2)，幫助產生免疫抑制性TME。CXL12和CCL5募集調節性T (Treg)細胞。但直接消融CAFs可促進CSC擴散，增強腫瘤侵襲轉移，從而降低生存率。因此，旨在將活性CAFs重編程為靜止狀態的微調治療是開發新治療方法的一種有吸引力的策略，特別是對于化療耐藥癌癥。

細胞代謝是由多種代謝酶介導的，在決定細胞命運和功能中起著至關重要的作用。腫瘤細胞具有獨特的代謝特性，如對糖酵解和脂質代謝的能量依賴性增加。乳酸和脂肪酸在TME中的積累顯著改變了浸潤免疫細胞和基質細胞的代謝通量和隨后的行為。因此，通過干擾關鍵的代謝調節因子來重塑TME似乎是增強當前治療策略的一個有吸引力的選擇。煙酰胺是維生素B3 (VB3)的一種形式，是細胞生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前體甲基轉移酶煙酰胺n -甲基轉移酶(NNMT)在包括脂肪細胞、肝細胞、癌細胞和CAFs在內的幾種類型的細胞中表達上調，為VB3代謝提供了另一種途徑。NNMT催化煙酰胺甲基化開始降解，消耗s -腺苷蛋氨酸(SAM)中的一個活性甲基。在過表達NNMT的細胞中，NAD+和SAM的細胞質儲存庫都縮小了。鑒于SAM和NAD+分別在組蛋白/DNA甲基化和組蛋白去乙酰化中的基本作用，它們的缺乏將導致基因表達的廣泛變化。因此，調節NNMT水平可能通過表觀遺傳調控將VB3代謝重編程與細胞功能重塑結合起來。納米顆粒(NP)介導的核酸和藥物遞送為基因表達調控提供了一種很有前途的策略。在本研究中，我們觀察到培養的CAFs表達的NNMT水平遠高于典型的癌細胞系，從而設計了一種以CAFs為靶點的NNMT調節NPs，作為克服乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結直腸癌等四種腫瘤模型化療誘導耐藥的通用工具。以介孔二氧化硅NP (MSN)為核心構建了兩種Gemini-like NPs，并將其裝載到TMEre響應水凝膠中，對CAFs和癌細胞進行雙管齊下的治療。CAFS靶向NPs (siNNMT-CAFS, siNNMT-MSN@CAFS膜的簡稱)被CAFS膜包裹以傳遞NNMT短干擾RNA，而癌細胞靶向NPs (Chemo-CC，ChemoMSN@cancer細胞膜的簡稱)被同型癌細胞膜偽裝，用于輸送相關的一線化療藥物(圖1a)。siNNMT-CAFS對NNMT水平的下調可重新編程CAFs中異常的VB3代謝，并重建SAM和NAD+的細胞池。這些代謝變化通過改變組蛋白甲基化和去乙酰化誘導基因表達譜的表觀遺傳調控，導致細胞形態類似于正常成纖維細胞，并降低了可能促進化學耐藥和免疫抑制的CAFs分泌因子的水平。siNNMT-CAFS治療有效地減少了腫瘤內的CSC、MDSC和Treg細胞群，并增加了細胞毒性CD8+ T細胞的募集。與Chemo-CC聯合使用時，兩種類型的Gemini-like NPs協同作用，觸發腫瘤抑制的epi免疫化療療效(圖1b)。作為概念的證明，單劑量的水凝膠共同遞送Gemini-like NPs可以實現化療耐藥的完全消退并賦予長期的T細胞記憶，以保護治愈的小鼠免受腫瘤的再次攻擊。這種基于VB3代謝重編程的CAFs靶向策略為克服癌癥化療耐藥提供了一種創新的視角，具有廣泛的適用性。

圖1：用于化學抗性癌癥的水凝膠遞送的Gemini樣NP的方案。

首先，CAFs可以通過轉化生長因子-1 (TGF-B1)從NIH/3T3成纖維細胞轉化，形成星狀形態，并獲得α -平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和成纖維細胞激活蛋白- α (FAP- rp)等生物標志物。

通過動態光散射(DLS)和zeta電位測量，負載負電荷siNNMT后，MSNs的水動力直徑增加(82.6±4.0 nm vs 106.4±8.5 nm)，表面電荷減少(36.9±1.5 mV vs 12.7±2.3 mV)。暴露于RNA酶后，游離siRNA容易被降解。通過透射電子顯微鏡成像，CAFS膜或4T1癌細胞膜涂層成功，顯示出明顯的核/殼結構(圖2a)。膜涂覆后，顆粒大小siNNMT-CAFS和EBN-4T1進一步增加，分別達到136.6±4.2 nm和125.3±4.4 nm。此外，細胞膜涂層導致siNNMT - MSN和ebn - MSN表面電荷的逆轉。siNNMT - CAFs和EBN-4T1的zeta電位分別為- 16.5±1.7 mV和- 12.5±1.4 mV(圖2b)。接下來，我們探討了CAFs或癌細胞是否優先攝取雙子座樣NPs。我們用siNNMTFAM-CAFS和EBN-4T1的1:1混合物孵育CAFs或4T1細胞進行共聚焦熒光成像。事實上，CAFs內部化了類似雙子座的NPs，并優先考慮siNNMTFAM-CAFS。相反，在4T1細胞中，febn -4T1的攝取占主導地位(圖2c)。流式細胞術也證實了這些觀察結果，表明這兩種類型的nps可以通過同型靶向不同地進入CAFs和癌細胞(圖2d)。CAFs中的VB3代謝重編程和染色質重塑NNMT消耗甲基供體SAM以阻止VB3轉化為NAD+。我們推斷，通過siNNMT-CAFS降低NNMT水平可以恢復SAM和NAD+的細胞池，這隨后誘導組蛋白甲基化和去乙酰化的變化，從而抑制CAFs的致癌表型(圖2e)。我們評估了與siNNMT-CAFS孵育的CAFs的代謝變化。NNMT的敲除提高了細胞中NAD+和SAM的水平，表明這種納米藥物可以恢復正常的維生素B3代謝和甲基供體池(圖2f,g)。由于SAM和NAD+分別在組蛋白甲基化和組蛋白去乙酰化中起著關鍵作用，我們進一步探索了與siNNMT-CAFS治療相關的組蛋白修飾的表觀遺傳變化。免疫印跡分析結果顯示，siNNMT-CAFS處理細胞中三甲基化組蛋白H3賴氨酸4 (H3K4Me3)和賴氨酸27 (H3K27Me3)水平大量升高，乙酰化組蛋白H3賴氨酸9 (H3K9Ac)水平明顯降低(圖2h)。我們還監測了CAFs中促癌細胞因子和趨化因子的表達，包括增強癌細胞干細胞性的IL6和IL8，誘導MDSC分化的CXCL1和CCL2，以及促進Treg細胞募集的CCL5和CXCL12。表觀遺傳重塑siNNMT-CAFS導致上述基因明顯的轉錄抑制(圖2i;)。總之，這些數據證實了我們的假設，即siNNMT-CAFS可以通過一系列代謝和表觀遺傳重塑誘導CAFs向靜止成纖維細胞轉變。

圖2：Gemini-like NPs的表征。

由于siNNMT-CAFS在CAFS靶向和CAFS重編程方面的潛力，我們進一步評估了siNNMT-CAFS@Gel在化療耐藥4T1三陰性乳腺癌(TNBC)小鼠模型中的療效（圖3a，b）。一劑siNNMT-CAFS@Gel導致耐藥4T1腫瘤的CAFs中nnmt_水平大幅下調(圖3c)。因此，我們觀察到腫瘤組織中Cscs、MDSCs (CD45+CD11b+Gr-1+)和Treg細胞(CD45+CD4+CD25+Foxp3+)的豐度明顯下降(圖3d - f)。此外，免疫抑制細胞數量的減少導致TME中cd45 +CD8+ T細胞的浸潤增加(圖3g)。這些結果表明，siNNMT-CAFS@Gel對TME的重塑促進了CSC的分化和免疫激活，可能分別恢復了腫瘤細胞對化療藥物和宿主免疫監視的敏感性。

圖3：Gemini-likeNPs的遞送和TME重塑。

隨后，通過Gemini-like NPs聯合治療化療耐藥TNBC接下來，我們測試了聯合遞送兩種Gemini-like NPs (siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel)或遞送任一種NPs的治療效果。在接種耐藥4T1細胞7天后，給藥單劑量無載或載np的水凝膠(圖4a)。通過生物發光成像實時跟蹤腫瘤進展顯示，siNNMT-CAFS@Gel或EBN-4T1@Gel組癌細胞信號略有減少，而siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel組信號逐漸消失(圖4b)。從腫瘤生長動力學分析中也觀察到類似的結果，共給藥組的所有小鼠腫瘤完全消融(圖4c)。值得注意的是，siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel組的所有小鼠都恢復并保持健康，沒有腫瘤復發或轉移的跡象(圖4d)。我們進一步分析了每組腫瘤中的CSC和免疫細胞群。siNNMT-CAFS@Gel和siNNMTCAFS/EBN-4T1@Gel將CSC和免疫抑制細胞群減少到相當水平，表明共孵育組TME重塑的影響主要歸因于siNNMT-CAFS對CAFS的重編程(圖4e-g)。此外，所有治療組均顯示血清中用于吸引CD8+ T細胞的CXCL-9水平、浸潤的CD8+ T細胞水平以及CD8+ T細胞分泌的干擾素和顆粒酶B (GZMB)水平升高，其中siNNMTCAFS/EBN-4T1@Gel組效果最顯著(圖4h)。上述數據提供了強有力的證據，表明兩種Gemini-like NPs通過靶向調節CAFs和腫瘤細胞協同作用，達到了優越的治療效果。

圖4：經由 Gemini-like NPs的化學抗性與TNBC的組合療法。

隨后，誘導T細胞記憶我們檢測了聯合遞送Gemini-like NPs治療小鼠的長期T細胞記憶反應。在單次給藥siNNMT - CAFs /EBN-4T1@Gel兩個月后，治愈小鼠接受4T1腫瘤細胞再攻毒(圖5a)。接種4T1細胞后，所有年齡匹配的小鼠均表現出腫瘤快速進展，而在30天的時間窗口內，只有一半的愈合小鼠出現腫瘤形成，生物發光信號明顯減弱，生長明顯延遲(圖5b,c)。我們進一步分析了腫瘤再接種三周后脾臟和腫瘤浸潤T細胞的中央記憶T (Tcm)細胞水平。與自然對照組相比，經siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel治療的小鼠CD8+和CD4+ Tcm細胞的比例均顯著增加(圖5d)。同樣，與自然對照組小鼠相比，siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel-pretreated小鼠募集了更高水平的腫瘤浸潤性CD8+和CD4+ T細胞(圖5e)。這些結果表明，雙子座樣NPs在誘導ofT細胞記憶中具有持久和有效的腫瘤再挑戰回憶反應的強大能力。

圖5：誘導T細胞記憶。

隨后，我們繼續評估這種納米治療策略在其他類型的化療耐藥腫瘤中的適用性。為此，對H22型肝細胞癌(HCC)、Panc02型胰腺導管腺癌(PDAC)和CT26型結直腸癌(CRC)的小鼠進行了反復治療索拉非尼(SFN)、吉西他濱(GEM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)在這些模型中獲得化學耐藥。成功誘導化療耐藥后，我們構建了三種類型的Chemo-CC用于靶向遞送相關化療藥物，免疫組織化學分析表明，siNNMTCAFS@Gel或siNNMT- CAFs /GEM-Panc02@Gel均能有效降低Nnmt的蛋白水平，效果相似，而游離siNNMT和GEM (siNNMT/GEM)或GEM-Panc02@Gel治療沒有效果(圖6a)。此外，從siNNMT-CAFS@Gel或siNNMT-CAFS/GEMPanc02@Gel治療的腫瘤中分離的CAFs 中，NNMT、CAFS標記物FAP- Rfs以及CAFs衍生的原癌細胞因子和趨化因子的表達水平顯著下調(圖6b-d)。接下來，我們研究了CAFs重編程在CSC分化和免疫激活方面的后果。一劑量的水凝膠給藥siNNMTCAFS或聯合給藥Gemini-like NPs可顯著降低sfn耐藥HCC、gem耐藥PDAC和5- fu耐藥CRC中CSC群體的豐度(圖6e)。相比之下，CSCs的水平不受SFNH22@Gel、GEM-Panc02@Gel或5-FU-CT26@Gel的影響。在以上三種類型的腫瘤中，一劑ofsiNNMT-CAFS@Gel治療提高了腫瘤浸潤性CD8+ T細胞的水平。因此，在這些類型的腫瘤模型中，共同遞送Gemini-like NPs顯示出對CD8+ T細胞募集的組合效應(圖6e)。腫瘤內共遞送游離siNNMT和化療藥物不會改變CSCs或浸潤CD8+ T細胞的比例，驗證了水凝膠遞送CAFS和癌細胞靶向NPs的優勢。最后，我們監測了單劑量雙子星樣NPs在這些耐藥腫瘤模型中的治療效果。在SFN耐藥的HCC中，腫瘤生長不受卸載的Gel或游離的siNNMT/SFN的干擾，并且受到siNNMT-CAFS@Gel或SFN-H22@Gel的輕度限制。相比之下，通過siNNMT-CAFS/SFN-H22@Gel聯合治療可根除腫瘤(圖6f)。與腫瘤進展一致，對照組或單一治療組的所有小鼠在癌細胞接種后48天內死亡，而接受聯合治療的小鼠在我們的觀察窗口(60天)內沒有死亡(圖6g)。

圖6：對化療耐藥的肝癌、胰腺癌和結直腸癌的適用性。

總之，在對各自的一線化療藥物耐藥的乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結直腸癌小鼠模型中，單劑量水凝膠共同遞送Gemini-like NPs可以恢復化療敏感性，誘導免疫激活，并實現腫瘤消退。此外，它還能刺激強健的T細胞記憶，長期具有抗腫瘤效果。因此，這項研究代表了一種具有廣泛適用性的創新方法來克服癌癥化療耐藥性。這些發現為開發廣泛適用的癌癥化療耐藥策略提供了一個有希望的前景。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37262365/